一、狂犬病病毒在分类学中的位置

狂犬病病毒归属在弹状病毒科(Rhabdoviridae)，弹状病毒科内几乎所有的病毒都是弹状或杆状形态，具有相似的蛋白与RNA结构；可分为5～6 个属，能感染人致病的仅如下两属，其一是水泡性口炎病毒属，属内典型的病毒是水泡性口炎病毒(VSV)；其二是狂犬病病毒属 (Lyssaviruses)，代表种是狂犬病病毒。

从昆虫、蝙蝠、鼩鼱、人体内曾分离到几种狂犬病病毒样病毒，称为狂犬病相关病毒（Rabies-Related Virus，RRV），RRV不一定都会引发狂犬病样疾病，但它们都具有与典型狂犬病病毒相同的核衣壳抗原，差异在于糖蛋白的抗原性。于1979年将它们 分类在狂犬病病毒属；目前，可将狂犬病病毒属分为7个血清型。第l血清型，代表株是CVS24，包括野毒株及各实验室保存的大部份毒株，是典型狂犬病病 毒。第2～7血清型是RRV；第2血清型，代表株是Lagos蝙蝠病毒；第3血清型，代表株是 Mokola病毒；第4血清型，代表株是Duvenhage病毒；第5血清型，代表株是欧洲蝙蝠病毒-1（EBL-1）从俄国人体中分离；第6血清型，代 表株是欧洲蝙蝠病毒-2（EBL-2），从芬兰人体中分离；第7血清型，代表株是从澳大利亚蝙蝠中新分离的。现有证据表明仅第l血清型病毒与人类狂犬病密 切相关，但有学者认为，除了第2血清型之外，其它血清型病毒均可导致人或动物感染死亡，例如Mokola病毒引起曾接种过狂犬病疫苗的狗、猫发生致死性感 染。

在属内尚有基因分型的提法，第1～7基因型与第l～7血清型基本是对应的。还有种群（phylogroup）的提法，按中和性单克隆抗体（McAb）的交 叉反应性及跨膜糖蛋白涉及的病毒-宿主互相作用性、免疫原性、致病性，可分为两个种群，第一群包括第1、4、5、6、7基因型，第二群包括第2、3基因 型。用第二群病毒对小鼠进行外周攻击，无致病性（5）。

二、病毒的性状

(一)形态结构

狂犬病病毒典型的形态是一端平坦或略凹状，另一端半圆形，酷似子弹，故得名弹状病毒。病毒大小为75～80×170～180nm。经组织培养 后，病毒的形态多呈两端平坦状的颗粒。电镜下可见病毒内部有50nm宽的核心，核心实质为核衣壳。

核衣壳由单股 RNA与核蛋白（N）组成，并与NS蛋白、多聚酶L蛋白缔结为核糖核蛋白体(RNP)；在RNP中，RNA呈螺旋对称排列、宽度18nm，被N 蛋白紧紧地镶嵌着；在RNP外面包围着一层基质（M）蛋白膜。再向外就是脂双层外包膜(Envelope)，在其表面上排列着有间距性的刺突，刺突是糖蛋 白（G）构成的三聚体、长约10nm；这种三聚体性刺突，也称为，刺突样的外包膜表面G蛋白突起（peplomers）。见图4-6-l。

(二)化学组成及其功能

狂犬病病毒除含有 RNA和蛋白质以外，尚含有类脂、碳水化合物。其含量比例为：脂类15～25%，糖3％，RNA约为3～4％，蛋白质65～75％。

l.病毒RNA 构成病毒基因组的是单股负链RNA。分子量3.5～4.6×106道尔顿、约为12Kb，PV株含11932个核苷酸；其中含有5个结构基 因，从3’端起，依次为核蛋白基因含1424个核苷酸、非结构蛋白（NS、或称P、M1）基因含991个核苷酸、基质蛋白（M2）基因含 805个核苷酸、糖蛋白基因含1674个核苷酸、大蛋白（L）基因含6475个核苷酸。在G与L基因之间存在一个不翻译的伪基因（ψ），这是与 VSV最大的区别,而且在负链病毒基因组中也是罕见的。在各结构基因之间均有一个核苷酸个数不等的间隔区，从3’端N基因下游开始，依次为 2、5、5、423个核苷酸。在结构基因区的两端还各有一段意义不明的片段，分别为3’端的58或56个核苷酸，亦称先导RNA； 5’端的70个核苷酸。见图4-6-2。

2．病毒蛋白质 有5种主要的病毒蛋白，据化学性质可分为磷酸化蛋白与非磷化蛋白，以及糖蛋白等。它们在病毒的感染、复制、致病与免疫等功能方面起重要的作用。不同来源的 病毒株其结构蛋白的分子量是略有不同的。这五种病毒蛋白分列于表4-6-l。

G蛋白是唯一暴露在病毒体外部的病毒蛋白。据其可弯曲铰链分为两个部分，含三个抗原表位区，某些株如ERA却有五个抗原表位区；①NH2端区部（Ⅱ区）： 含抗原Ⅱ表位区直到线性区253～275位氨基酸，包括Ⅵ表位264位氨基酸；②COOH端区部（Ⅲ区）：含抗原Ⅲ表位区及跨膜区、胞浆区，Ⅲ表位区中 AflⅢ的第333位氨基酸残基是决定毒力的关键性氨基酸；此位点氨基酸的改换，会减弱病毒在细胞间的扩散，并限制病毒在CNS中的复制。

G蛋白的作用：①与病毒对细胞的吸附以及介导细胞摄取病毒有关；②它的胞浆功能区必须优先与RNP-M复合体相互作用，才利于病毒出芽，两者错配则足于使 病毒减毒（6）；③G蛋白过量表达会引起受感染神经元的机能损害，而且G蛋白过量表达或大量堆积会造成神经元细胞凋亡。反之则会损害病毒体的自身功能。

另外，在组织培养中存在着大量的可溶性G蛋白（Gs），它是由细胞直接分泌至培养液中的游离物，Gs的羧基端比正常G蛋白少58个氨基酸，分子量为 61kDa。Gs的免疫原性较差，免疫动物后，不能保护动物免受致死性病毒攻击。

3．病毒的脂类与糖类 病毒的糖类，主要与蛋白结合成糖蛋白，其次则是与脂类结合而成的糖脂，糖脂是构成包膜的一种成分。病毒的脂类，有磷脂、糖脂等极性脂肪，中性脂肪的主要成 分为胆固醇，脂类物质是构成病毒包膜的主要成分之一。狂犬病病毒是通过出芽方式释放，病毒的包膜是来自内质膜，故每株病毒在不同的宿主细胞内复制后，其脂 类成份及其含量比例都有所不同。病毒的形态、抗原性、吸附、脱壳都与包膜有很大程度的关联。

（三）某些理化特性

完整病毒体的等电点为：6.7～6.9；沉降系数为600～625S；悬浮密度，在氯化铯中为1.16～1.2g/cm3；在蔗糖中为1.14～1.17g/ml。

三、病毒的特性

(一)生物学特性

1．组织嗜性 狂犬病病毒最大的特点之一，就是对神经组织的嗜性远远大于其它组织。在神经组织内病毒复制的比率远比在其他组织内高。无论是野毒株还是减毒株，都具有嗜神 经组织的特性，仅程度略有差异。唾液腺对病毒的敏感性又比其它组织细胞高。

病毒在神经细胞复制过程中可形成包涵体，亦称尼基氏小体(Negri body)，包涵体在胞浆内形成，大小为2～30μm；形态可为球形、卵圆形。电镜观察可见，包涵体内含有完整的病毒体以及病毒核衣壳的大基质、外 壳蛋白等。包涵体主要在大脑海马回部的锥体细胞、小脑的蒲肯野细胞、脊髓后角细胞、以及皮层神经元内出现，它可作为狂犬病的确诊指标之一；此外，还可把有 尼基氏小体出现部位，看成为有活动性病毒复制的区域。

2．抵抗力 狂犬病病毒对温度较敏感，60℃30秒、100℃2秒即可使病毒灭活。在20～22℃条件下1～2周、4℃时5～6周，其感染性几乎完全丧失。保存液内加 入正常血清或白蛋白可保护病毒的感染性。用中性甘油(50%)保存的感染组织块，在-20℃以下可保存4～5年。病毒悬液在冰冻或冷冻干燥条件下稳定，冻 干后4℃保存可达数年其感染性下降不明显。病毒对紫外线、日光也较敏感。甲醛、酚、β-丙内酯、三磷酸三丁酯、汞、50～70%乙醇、碘酊、肥 皂、20%乙醚、10%氯仿、胰酶、氧化剂、表面活性剂、有机溶剂、以及在溶液pH 3～11范围外的pH均可使病毒灭活。但硫柳汞、磺胺、抗生素等不能灭活病毒。

据上述特性，病毒的保存多采用深低温如-70℃下加50%甘油保存，或者加小牛血清作为保护剂在低温条件下保存。生产疫苗用毒种多采用冷冻干燥法保存。

(二)抗原组成

以前认为狂犬病病毒抗原性是单一的，各株之间无型的差异，但以McAb分析研究之后，发现巴斯德毒株与其后代以及其它毒株的抗原差异较明显，在核衣壳上存 在着不同的抗原群。尽管存在着差异，但目前所使用的疫苗病毒对街毒是有交叉保护作用的。

1．核衣壳抗原 即N蛋白抗原，①引出补体结合抗体，②是狂犬病病毒的属抗原、群抗原，可用于病毒的分类与鉴定。③是一种免疫保护性抗原，也介导细胞免疫。

2．糖蛋白抗原 它位于病毒包膜的刺突上，是一种免疫保护性抗原，它还具有结构标志性抗原的性质。①引出中和抗体；同时也是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的靶点。②血清型 抗原是标志性抗原，可用于病毒学分类与流行病学的监测。③作为血凝素（凝集鹅红细胞），可引出血抑抗体。④它某一位点的氨基酸变化，是用McAb分析强毒 株与弱毒株分子差异的基础。

3．第三类抗原 曾有报道，存在着第三种抗原，能引出细胞溶解性抗体，后者在补体的参与下，溶解受感染的细胞。最近，用McAb分析表明，此类抗原决定基 （epitope）与血凝素抗原决定基重叠。目前对它的本质尚不够了解。

四、病毒的培养与病毒复制

(一)病毒的培养

1．病毒接种在哺乳动物脑内，经3～7天，病毒可在脑内增殖，取其脑组织匀浆离心后，即为所培养的病毒。

2．用6～8天龄鸡胚或其它禽类的卵胚培养病毒，以绒毛尿囊膜腔接种法，在种毒后第8～10天，病毒生长增殖达到高峰，而胚胎发育却不受影响。

3. 狂犬病病毒对所有的哺乳类动物的细胞及禽类胚胎细胞均敏感，病毒接种在细胞中，培养3～7天便可生长增殖，在不同的细胞中病毒生长增殖的速度与产量有较大的差异。

（二）病毒的复制

复制的某些特点：①快速吸附与穿入：一般认为病毒颗粒在30内分钟就能吸附到敏感的细胞上。②隐蔽期短：6～8小时。③复制周期完成时间：19～24小时，最快为6小时。

病毒增殖性复制过程的九个步骤，依次为吸附、穿入、脱壳、转录、翻译、加工、复制、装配、成熟出芽。病毒与宿主细胞的吸附作用取决于病毒糖蛋白与细胞表面 受体等的相互作用与结合，例如，细胞表面的烟酸乙酰胆硷受体（NAchR）、神经细胞粘附分子（NCAM，即CD56）、以及碳水化合物（主要是糖脂 类）、磷脂、神经节苷脂、某种蛋白受体。病毒通过包膜与宿主细胞膜融合或者是病毒饮入(Viropexis) 进入宿主细胞。病毒体在细胞内降解、释出核衣壳，在某些酶的作用下脱壳；之后，病毒基因组转录与复制。转录翻译有关的酶，合成子代病毒蛋白，在胞浆内形成 核衣壳，核衣壳的堆集形成尼基氏小体；核衣壳与M蛋白结合进行装配，通过出芽的方式获得宿主细胞的生物膜，从而成熟为完整的子代病毒颗粒。

五、病毒的变异

RNA病毒具有高度的变异率，每株病毒普遍都由复杂群体组成，这可根据其基因组结构予以区分，在恒定环境条件下，这种群体保持相对的稳定。狂犬病病毒也是 如此，在每一特定的狂犬病病毒株内，显性变异与特殊宿主相关，容易鉴定并易于与其它毒株区分开来，即使因偶发突变而可能不断地出现新的变种，但稳定的复杂 群体因其已适应于特定环境，故仍保持现状不变。

病毒的减毒通常都来自于毒力株，经过选择性过程后，减毒株则由混合群体组成，虽含有次要变异体但仍可保留致病性。例如，CVS-24至少由两个具有不同致 病性质的变异体组成，如适应于BHK细胞的CVS-B2c与适应于神经组织的CVS-N2c，它们当中的任何一个都是依赖于环境的主要群体；但是CVS- N2c的神经嗜性和致病性却比CVS-B2c高50倍（7）。在每株病毒内，糖蛋白的变异可达10个氨基酸被替换，这可导致致病性减弱或丧失，例如， CVS-N2c的G蛋白功能区如果被SHBRV-18（R-N2cT）的G蛋白功能区代替之后，会使CVS-N2c在肌肉注入途径时失去致病性。

虽然，我国的学者对不同地区分离的狂犬病病毒株进行了核酸测序分析，其结果表明不同地区的毒株是有区别，而且个别毒株的差异较大，但是，目前尚未发现，这些核酸序列的变异足于造成抗原性和免疫原性的重大改变。

(一)街毒与固定毒

这是两个概念不同的定义，街毒与固定毒的根本差别在于致病力的不同，而不是抗原性的不同。街毒：是指存在于自然界感染动物体内的病毒，亦称野毒，其对人致 病力强。固定毒：则指于实验室条件下街毒经过动物体内连续传代后而得之病毒；因其在动物体内连续传代后的潜伏期逐渐缩短至5-7天时，再也不缩短，呈有规 律的固定潜伏期，因之而得名；其对人致病力弱，但仍保持其原有的抗原性。街毒与固定毒各自的生物学特性见表4-6-2。

现在世界各地实验室内保存的巴斯德毒株及其减毒株，最早从疯牛分离得到，在家兔脑内连续传90代以上而成为固定毒。我国用于疫苗生产的原始毒种 ——北京株，就是在从狂犬神经组织分离后，在家兔脑内连传50代所得的病毒。见表4-6-3。现在世界上多数固定毒均由这种家兔 脑内连续传代法获得，这是一种人工定向变异的减毒方法。

我国学者对G蛋白的分子生物学分析显示，街毒与固定毒G蛋白的核酸序列同源性大都低于90%，最低者为82%；它们的氨基酸序列同源性约为90～93%。 在固定毒之间核酸序列同源性则都在90%左右。然而，与狂犬病病毒神经组织嗜性最为相关的是G蛋白第333位的氨基酸残基，即精氨酸（Arg333），如 果替换成赖氨酸（Lys333）或谷氨酰胺（Gln）、谷氨酸后，病毒的毒力或嗜神经性会明显减弱。街毒G蛋白必定是Arg333，减毒株、无毒株以及部 分固定毒株此位点则为其它氨基酸如甘氨酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、蛋氨酸等所代替。此外，第330位的赖氨酸、第336位的天门冬酰胺、第338位的异亮 氨酸也都是决定致病力的分子基础。

(二)缺损干扰颗粒(Defective-Interfering particles，DI颗粒)

把正常的病毒称为“标准病毒”，把那些形态不同、基因组有缺陷、且又干扰正常病毒复制的病毒称之为“缺损干扰病毒颗 粒”；DI颗粒的形态比标准病毒短1/3～1/2，且呈非弹状形，有大段基因缺失，基因缺失甚至可达50%。其免疫原性较差。经过长期组织培 养或高浓度的脑内传代后，会产生较多的DI颗粒。这是在疫苗研究和生产中值得注意的问题。