一、存在的问题

(一) 不同地区的病毒变异问题

近年来，我国狂犬病发病率有所回升，而且通过研究表明，不同地区的狂犬病病毒株其核酸序列存在着一定的差异，差异最大者，其G蛋白同源性仅为84%。现在，有必要了解这种核酸序列的差异是否会影响到疫苗的保护效果。

（二）早期诊断

现有的诊断试剂均是测定抗体的，然而，在症状出现前若能确诊为已被感染，对指导使用疫苗、抗血清等才有实际意义。PCR技术和核酸杂交技术检测体内的微量 抗原是可行的，可作为早期诊断技术与试剂。乳胶凝集试验检测狗唾液病毒的结果与荧光抗体试验法相当。

（三）工艺技术与检定方法的改善

目前，我国Vero细胞培养狂犬病疫苗的生产工艺均以转瓶细胞培养法，此工艺无法实现疫苗的大规模生产，因此，大规模细胞培养技术已成为大批量生产狂犬病 疫苗的制约因素。利用生物反应器大规模培养细胞技术可解决此问题；同时也是疫苗制造工艺的发展方向。

NIH效力测定法存在一些问题，例如：同一批次疫苗在不同的时间和操作者的不同，其检定结果可偏差3倍，而且，攻击毒的毒力、参考对照疫苗效力单位的高低 等均可影响结果。国外许多厂家为了减少这种误差，均做双份检定，取平均值作为疫苗的效力单位。在尚无更好的测定方法的情况下，这不失为一种补救的办法。

近年来，已有许多学者在探索以测定疫苗抗原含量的标准来确定疫苗的效力单位。

二、发展中的疫苗

(一)基因工程重组疫苗

利用基因工程技术开发新型疫苗，其中核酸疫苗和亚单位疫苗可用于人类。重组体疫苗和基因工程活疫苗主要用于野生动物和家养动物。

1.重组体疫苗 某种载体病毒经基因工程改造后，在其包膜上表达自身蛋白的同时又表达另一异源蛋白抗原。将G蛋白基因逆转录成cDNA片段，插入痘病毒基因组内，再将这种 带有外源基因的痘病毒感染BHK-21细胞，收取病毒悬液，经蔗糖梯度离心部分纯化制得“痘病毒-狂犬病病毒糖蛋白重组体病毒” (V-RG) 疫苗，使用对象是野生动物，狐、浣熊经口服免疫后，中和抗体水平为0.6～54IU，抗体维持时间较长。

VRG疫苗的安全性受到质疑，2001年美国学者曾报道，一妇女被她所养的狗咬伤后，出现痘病毒感染，经实验证明此痘病毒与该狗曾接种的疫苗是同一病毒（17）。

2. 基因重组亚单位疫苗 在国外，用痘苗病毒作为表达载体，分别表达G蛋白、N蛋白、NS蛋白与M蛋白，但是G蛋白与N蛋白的免疫保护效果明显高于NS蛋白与M蛋白亚单位抗原。在 我国有报道，将G蛋白与N蛋白的基因引入载体病毒基因中，可同时表达这两种蛋白；也可构建成融合蛋白形式。表达载体有昆虫细胞、酵母菌等。以此表达物免疫 动物较单一G蛋白免疫效果好，T细胞的应答作用明显，协同免疫效应增强、有较好的抗街毒攻击保护效果。疫苗的使用对象，既可是动物又可是人。现尚在实验室 阶段。国外有报道，以酵母菌表达G蛋白的同源类似体，分别为68KD和65KD分子量。

3. 核酸疫苗 国内外进行的核酸疫苗研究，主要集中在G蛋白与N蛋白基因的选取上，表达载体多选取带有病毒启动子的质粒等，其抗体阳转率在30～50%之间或者略再高 些，抗体滴度亦不甚理想。有报道，用含抗原结构基因的质粒作为裸露DNA疫苗，以基因枪肌肉接种8个猴，然后以致死量病毒攻击，8个猴均存活。总体说来， DNA疫苗的弱点是，在接种后30天内，难以测到抗体，故不适合作为接触后的预防免疫，而且其免疫效果等也尚未达到人用常规疫苗的水平，仍需进一步的改 进。目前也仅在实验室阶段。对核酸疫苗的原则性要求：有足够量的基因进入机体；在体内能表达足够量的抗原；并能较快地有效激活免疫系统；而且远期安全性好 （指整合、诱变等）。

但是，也有些学者据小鼠试验结果提出相反的观点，认为仅单一剂量的DNA疫苗用作接触后的预防免疫其保护率为53%、第7天出现抗体阳转，5针次CCV的保护率为40%（18）。

4.基因工程活疫苗 野生动物常规使用的改性活疫苗（modified-live）是口服的SAD B19、SAG-2以及VRG疫苗，对狐是非常有效的，但对臭鼬的效果不显著或无效。因此，美国的研究人员用基因反转法和基因工程点突变法，将G蛋白的 Arg333替换成Gln333、以及改变胞浆区及胞浆外区的氨基酸序列，这种改构的病毒体对外周神经无神经侵染特性（19）。此活疫苗的使用对象是野生 动物。

口服活疫苗必须满足的关键点：①疫苗病毒应能在受者体内复制，以至有足够量的抗原被提呈给免疫系统；②疫苗病毒株的抗原组成与攻击毒株应紧密关联；③疫苗 必须能引出或提供足够的保护性免疫。④活疫苗毒株应该降低入侵神经的能力。在构建新型活疫苗时，也可考虑利用G蛋白胞浆功能区与RNP-M复合物之间的错 配足于使病毒减毒这一原理。

在过去的研究中，疫苗抗原的重点均放在G蛋白，但近年来有些报道，以纯化的RNP或重组的N蛋白作为疫苗抗原进行动物试验，结果显示均有较好的保护效果。 如果先以N蛋白刺激宿主，再用CCV接种，可加快机体出现高滴度的抗体。

(二)探索性研究的疫苗

1.口服疫苗 将分离纯化的ERA株RNP作为疫苗抗原，免疫小鼠能激惹特异性T细胞以及引出抗N蛋白特异性抗体。RNP经口服与肌肉注射途径均可引出血清IgA和 IgG抗体应答；如果再给予灭活疫苗加强免疫，能刺激产生较高的中和抗体量。

2.转基因植物表达抗原（植物病毒表达抗原） 利用植物病毒——烟草花叶病毒的重组嵌合体在菠菜叶中表达狂犬病病毒G蛋白的两种抗原决定基，将这种菠菜叶以胃插管法或喂食法口 服免疫小鼠，确实能引发局部和全身免疫应答，产生血清IgA和IgG中和抗体；经肌肉注射作为第三次免疫刺激后，约有40%的小鼠能够对抗致死量狂犬病病 毒的攻击。

3.其它亚单位疫苗

（1）免疫小体与病毒小体 去除灭活病毒的核心，将糖蛋白与脂质体交联形成免疫小体。注入机体可引出高水平的中和抗体，并能耐受街毒的攻击；推测其保护效果比纯化的G蛋白或病毒小体 要高20倍；而且稳定性好。（2）抗独特型McAb作为疫苗抗原，1983年以前曾有报道，用Ab2-β型抗独特型抗体，免疫动物可引出低滴度 的中和抗体。

4.混合多价疫苗

用液体吸附型破伤风类毒素来溶解冻干型狂犬病疫苗，立即给被疯动物咬伤者使用，有明显的协同促进作用，为试制破伤风类毒素与狂犬病疫苗二价疫苗奠定基础。

（三）佐剂的研究

目前疫苗的佐剂是氢氧化铝、皂角苷类的QS21，但是，氢氧化铝的有效性是受到质疑的。免疫刺激复合物(ISCOM)主要用于兽用口服疫苗，抗原与皂角苷 胆固醇等物形成乳化小颗粒；实验证明ISCOM的免疫原性比原制苗要高几倍。

近年来，有许多佐剂的研究，其中有细胞因子和CpG。CpG是一种未甲基化的二核苷酸基序（motif），含6个核苷酸；CpG-ODN则是含CpG基序 的寡核苷酸，又称特异性免疫刺激序列（ISS），来自细菌的质粒核酸。业已证明它具有强烈的佐剂性，能引出Th1型免疫应答，参与IgG2a定向应答；它 还提高抗体应答的血清阳转率并能扩大抗体的产生量。它提高细胞表面共刺激分子的表达，它刺激NK细胞产生IFN-γ；以及提高NK的溶细胞活 性。目前在哺乳类动物中的研究不多，仅见于HBsAg、BCG、HIV-DNA疫苗、流感病毒亚单位疫苗等研究。有望为狂犬病疫苗探索出一种新的佐剂。它 可用于多种疫苗制剂包括DNA疫苗。

1979年WHO公报中曾提出，在疫苗中加入干扰素及其诱生剂，比单一使用疫苗更有效。有研究表明，来源于沙门氏菌脂多糖的单磷酸脂A（MPL）亦可作为DNA疫苗的佐剂。

三、接种途径和免疫接种计划

WHO于2002年提出，由于经济和疫苗供应的问题，可考虑将多位点的皮内免疫接种途径推广应用为接触后的疫苗接种方法，从而降低疫苗需要量的60%；但 应慎重评价其免疫效果；而且必须使用组织培养疫苗；WHO提出这种建议的原因是出于，多位点的皮内免疫接种途径从1982年起经多次现场考察，证明也是一 种有效的免疫途径，同时又可以节省疫苗使用量。另一方面，对于那些狂犬病猖獗的社区，WHO也鼓励经仔细地设计，将现代狂犬病疫苗接种列入婴幼儿和儿童的 早期免疫计划中。

四、治疗用特异性抗体

从发展趋势看来，单克隆抗体（McAb）作为治疗制品是有利的，无论是鼠源性的还是人源性或人源化的，只要McAb的特异性与针对性是抗病毒致病原性的， 例如抗G蛋白致病决定基的McAb，均可抑制细胞之间的病毒传播,为机体提供早期的被动免疫保护。此外，因McAb可被狂犬病病毒感染的细胞所内化从而进 入细胞，它在胞内可抑制病毒脱壳。

从另一方面看来，McAb制备技术不但可保证大量生产以满足临床使用的需求量，而且也可提高产品质量及药效，这因为其特异性高针对性强、而且因其比活性高 于HRIG，故所使用的蛋白量低，这是它的优势所在。因此，WHO也希望McAb是一种值得发展的新技术方向，而且提出McAb作为抗狂犬病治疗制剂应是 2～3种McAb混合的鸡尾酒型制剂。

最近有报道，利用人源性抗狂犬病病毒的中和性McAb进行叙利亚地鼠接触后的预防治疗性试验（20），7株McAb和对照的RIG在体外基本不中和第2至 第7血清型的RRV。对狂犬病病毒攻击后的保护作用与RIG相同，同时也仅对个别RRV产生保护；有1株McAb对地鼠所提供的保护与RIG相当， McAb有希望成为RIG的代用品。研究者还认为，IgM类的McAb中和效应无法与IgG类McAb相比，而且，尽管使用高剂量，但仍不能提供保护效 果，这因为是IgM空间效应所致而不易接近狂犬病病毒，并且IgM只能留在循环系统内，反之IgG则容易穿过各种组织。